郝培研究组利用RNA编辑策略实现了反转录转座子的编辑干预。

2020年5月19日，Cell Discovery在线发布中科院上海巴斯德所郝沛研究员，发表利用RNA编辑策略、编辑介入逆转录酶的联合研究论文：“interferingwithretrotranspospose

本研究利用逆转录病毒/逆转录酶生命周期具有DNA和RNA两个不同阶段的特性，首次采用RNA编辑策略，实现逆转录酶Tf1 (类似逆转录病毒的模式生物)的编辑干预

同时，这项工作首次使用CRISPR-Cas12a编辑逆转录病原体的DNA阶段，达到了100%的编辑干预效率。

该研究开辟了逆转录病原体(包括外源逆转录病毒、内源性逆转录病毒和逆转录转座子)编辑干预的新思路。

为将RNA编辑和DNA编辑技术应用于逆转录病毒感染阻断、器官移植中内源逆转录病毒失活，以及基因资源培育中逆转录酶抑制，提供了新的技术策略并建立了系统参数。

近年来，CRISPR系统开始发展成为对抗逆转录病原体(包括外源逆转录病毒、内源性逆转录病毒、逆转录转座子)非常有前景的关键技术。

外源性和内源性逆转录病毒是引起人体疾病的严重原因，也是器官移植(同种和异种器官移植术)的重要风险因素。

导致疾病的著名外源性和内源性逆转录病毒包括HIV-1、HTLV-1、HERV-K等。

前期科学家在CRISPR-Cas9编辑中尝试清除患者体内的HIV-1，抑制器官移植供体猪体内内源性逆转录病毒( ERVs )，消除逆转录转座子Tos17在水稻育种中的干扰，取得一定进展。

文章的示意图(图来源于Cell Discovery ) )。

近年来发现的专门用于RNA编辑的CRISPR第VI亚型Cas13为逆转录病原体的编辑介入提供了新的可能性和技术策略。

由于逆转录病毒/逆转录酶生命周期具有DNA和RNA两个不同阶段的特性，理论上RNA编辑方法可以通过编辑RNA中间体有效地干预和对抗逆转录酶病原体，但这一技术策略

近年来还发现，与CRISPR-Cas9类似、作用于DNA的CRISPR第v亚型Cas12a具有对PAM区的不同要求、自身处理产生crRNA的能力、更高的靶向效率等优良特性。

但迄今为止，Cas12a尚未应用于编辑参与逆转录病原体的报道。

构建了Tf1逆转录传输的报告系统：

为了应用RNA编辑(利用Cas13a )的技术策略和Cas12在逆转录病原体编辑中的参与，库佩项目组和合作者首先建立了Tf1逆转录转录报告系统。

他们向Tf1的NEO基因导入反向内含子(构建最多4种不同的内含子序列)，这样Tf1转录剪接后新形成的Tf1产物没有这些导入的内含子。

并通过设计crRNA，在实验中将这些新形成的不含内含子的Tf1产物特异性靶向。

首次证明RNA编辑显著参与可抑制Tf1逆转录转录座位活性：

郝沛项目组与合作者设计了Cas13靶向Tf1中间转录本的两个特异性和随机对照实验，对Tf1转录活性有显著的编辑抑制效果，分别为16%和60%。

这些结果首次证明RNA编辑是逆转录病原体的有效干预策略。

此外，比较Cas13a与靶标结合被激活后(由于其过度切割活性)原核宿主细胞生长停滞的现象，未观察到Tf1在真核宿主中活化而导致细胞生长停止的现象。

这提示了RNA编辑技术在真核宿主中的安全性，表明Cas13a在真核细胞和细菌细胞中的作用机制不同。

首次采用CRISPR-Cas12a实现逆转录病原体DNA阶段的编辑干预：

设计Cas12a靶Tf1逆转录酶的多个特异性位点( 5个crRNA设计)并随机对照实验表明，Cas12a对Tf1逆转录酶有明显的编辑抑制作用(达90% )—尚存的tf1 –

研究人员推测剩下的易位活性是Tf1中间产物受VLP包装保护的结果。

因此，进一步延长crRNA表达时间，最终完全消除剩余易位活性，达到100%的编辑干预效率。

这些研究成果开辟了编辑干预逆转录病毒/逆转录转座子的新思路和新方法。

比较RNA编辑和DNA编辑的不同作用机制，完成两种机制对逆转录酶病原体复制和转座子编辑干预效果的定量分析，为新技术战略的发展奠定基础，提供系统参数。

该研究由中科院上海巴斯德所郝沛研究员、中科院分子植物卓越中心合成生物学重点实验室李轩研究员、美国密歇根大学王红兵( Hongbing Wang )教授合作完成。

张牛冰和荆新云是共同第一作者。

相关工作得到了国家重点研发计划、中科院战略引领项目、自然科学基金项目的支持。

参考消息：

3359 book 020/articles/s 41421-020-0164-0