dpph法是什么方法，一起来看看！

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在植物提取物检测项目中，抗氧化活性是重要的评价指标之一。抗氧化活性评价主要是通过试验了解提取物的抗衰老、抗疲劳、抗炎等生物活性的检测项目。以槐米为例，由于含有丰富的黄酮、皂苷和甾醇等生物活性物质，槐米被公认为是目前最具有抗氧化活性潜力的农业废弃物之一。槐米中提取的芦丁，具有良好的抗氧化活性，此外在降血清胆固醇、降血压、降血脂、降血糖和提高免疫力等多方面具有良好的功效。所以，以槐米为资源开发以芦丁、槲皮素等为代表的抗氧化活性物质可以广泛地应用到食品、保健品和药品工业领域，形成高附加值产品用。因此，抗氧化活性也就成为评价植物提取物产品开发和质量控制的关键指标之一。

一、需求背景

河南某生物科技公司是以主要生产芦丁提取物、槲皮素提取物、花青素提取物、茶多酚提取物等植物提取物产品，为很多保健食品 、功能食品、药品提供原料的厂家。由于这些产品主打抗氧化活性，所以需要对其抗氧化活性进行评价，但是在现行国家标准、行业标准、地方标准、团体标准和企业标准中，均无相应的测定方法标准，所以委托我们制定一份植物提取物的抗氧化活性评价检测方案。

二、主流抗氧化活性评价方法介绍

目前，植物提取物中抗氧化活性评价方法主要根据受试对象可以分为体内法和体外法二大类。体内方法以丙二醛、超氧化物歧化酶、谷胱苷肽等为指标，测定其含量来评价体内抗氧化活性的高低。体外抗氧化评价体系则以自由基清除法、氧化还原法为主。体内方法的优势是更接近人体结果，但一般费时费力，且只能反映某一指标活性的高低。体外方法则很好地弥补了体内法的缺点。其中，1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)法是应用最广泛的抗氧化测定方法。

必须注意的是，常规的比色皿模式的 DPPH 测定法将DPPH 溶液与样品直接混合，因此检测得到的是样品总的抗氧化活性。然而，植物提取物原料通常是多元抗氧化活性物质混合物。当这些物质混合在一起被 DPPH 法测定的时候，相互之间可能存在抗氧化拮抗或协同的效应，导致检测评估结果偏低或者偏高。

此外，在很多评价任务中，仅仅测定混合物样品的总抗氧化性常规的抗氧化活性评价方法基于DPPH 分子与自由基混合后体系的颜色变化，利用紫外-可见分光光度计监测其吸光度值变化可以实现对样品中总抗氧化活性的定量分析。但必须注意的是，这种抗氧化评价方法有一个固有的缺点：检测选择性差。更确切地说，当样品中含有两种或者两种以上的抗氧化活性物质的时候，分析结果无法区分每一种物质的抗氧化活性高低。

三、薄层色谱法介绍

薄层色谱法是建立在薄层色谱和 DPPH 显色反应联用基础上的抗氧化分析方法，因为兼备选择性高和通用性好的优点，所以近年来广泛应用到植物提取物分析的一项色谱分离技术。与柱色谱的闭环工作原理不同，薄层色谱是一个去中心化、开放的分析系统，分离过程结束后分离结果被保留在色谱板上而非废液瓶中。这一独特的优势使得薄层色谱的分离结果可以方便地与很多无法与传统柱色谱系统兼容的检测手段实现无障碍融合。因此，薄层色谱不仅是一种通量大、操作简便和灵活性高的色谱工具，而且还可以作为多种离线检测方法高效集成融合的分析平台，在分析通量、简便性、精密度和适用范围等方面达到了较为理想的平衡，因此在植物提取物活性评价方面有良好的应用前景。

更重要的是，薄层色谱法是目前唯一能与生化反应直接联用的色谱工具。和传统的试管法测试不同，薄层色谱的色谱分离结果开放性和反应载体功能可以从根本上解决基于 DPPH 变色反应的抗氧化评估方法选择性差的问题。薄层分离使原本混在一起的不同抗氧化物质按分子结构的差异移动到薄层板上不同的位置形成物理隔离，因而可以有效避免各种物质之间可存在的协同或拮抗效应；随后，通过浸渍方式与薄层板耦合的 DPPH 溶液可以方便地实现对混合物中不同抗氧化组分的同时评估。因此，相对于传统的方法，建立在薄层色谱和 DPPH 显色反应基础上的抗氧化评价方法更加可靠。

目前，薄层色谱法已发展具备一整套完整的仪器化操作平台，在点样、展开、浸渍衍生和扫描定量过程中均实现了半自动甚至全自动化，显著扩展了应用范围。其中，半自动薄层点样仪在高压氮气流的协助下，点样针内的液体样品以极细的液流形式被吹扫至色谱板上，点样体积通常在 1~10 μL 范围内。通过非接触吹 扫法进行条带状点样，可以显著提高分离后相邻斑点的分辨率。薄层色谱分析过程中，所有步骤独立并配备相对应设备，可同时进行操作和分析，不仅提高了工作效率，也增加了仪器选择的灵活性。仪器化的操作平台在很大程度上提高了色谱分离的灵敏度及色谱展开图的分辨率，同时可视化成像后的光密度扫描提高了结果的准确性和重现性。

四、薄层色谱法要点分析

采用薄层色谱法来评价植物提取物的抗氧化活性，主要是利用硅胶薄层色谱对槐米提取物的甲醇溶液进行展开，实现对其中多种抗氧化物质的色谱分离，然后通过浸渍的方式将停留在硅胶薄层上的分离结果与 DPPH 显色反应相耦合，显色反应结果用光密度扫描仪定量检测，检测结果以芦丁为内标加权定量计算评估槐米样品综合抗氧化能力。我们可以通过分析代表性抗氧化活性化合物的分子结构特点，来优化色谱分离和 DPPH 显色等关键技术参数。

该方法的要点有：

（1）以甲醇为溶剂提取槐米提取物中的抗氧化活性成分

（2）通过超声进行辅助提取

（3）采用硅胶薄层板为固定相

（4）乙酸乙酯 乙酸 甲酸 水 10 1.1 1.1 2 mL 为流动相

（5）浸渍 DPPH 溶液显色 15 分钟

（6）荧光模式，D2&W 灯，激发光波长 530 nm，无滤光片，狭缝尺寸 3.00 × 0.30 mm (Micro)，扫描速度 100 mm/s, 数据分辨率 100 μm/step。

通过上面的分析，我们可以很容易了解到目前来看薄层色谱法在评价植物提取物的氧化活性方面，具有更稳定、可靠和实用性。植物提取物样品中往往不止一种抗氧化活性成分，所以想要实现对提取物样品中所有抗氧化成分的综合活性评价，就需要更精确的去定量测抗氧化活性物质含量，只有这样才可以更加客观地表征提取物作为药品和食品原料品质。我们通过使用芦丁作为伴随外标，对所有样分离得到的所有抗氧化峰信号面积进行归一化计算，得到抗氧化指数，就可以对该样品的抗氧化活性进行整体评价， 该生物科技公司对该方案也表示极为认可。大家如果有植物提取物检测相关的疑问，欢迎留言讨论。